Hi-T4™ 耐热 DNA 连接酶--NEB(北京)

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Hi-T4™ 耐热 DNA 连接酶                              收藏

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#M2622L
100,000 units
3,029.00元
#M2622S
20,000 units
739.00元

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特性

  •  Hi-T4 耐热 DNA 连接酶是 T4 DNA 连接酶经基因工程改造过的酶,与 T4 DNA 连接酶相比,改善了热稳定性
  • 不仅能够连接平末端和粘性末端,还能修复双链 DNA 和 DNA/RNA 杂交链的单链切刻
  • 随酶提供 T4 DNA 连接酶缓冲液和 StickTogether™ DNA 连接酶缓冲液

概述

 Hi-T4™ 耐热 DNA 连接酶是 T4 DNA 连接酶的耐热变体,该酶催化双链 DNA 或 RNA 上相邻的 5´ - 磷酸末端和 3´ - 羟基末端形成磷酸二酯键,经过改造其作用温度高于野生型 T4 DNA 连接酶。Hi-T4 耐热 DNA 连接酶可在温度高达 50ºC 时进行平末端和粘性末端的连接以及修复双链 DNA 、RNA 或
DNA / RNA 杂交链的单链切刻。

图1:Hi-T4 耐热 DNA 连接酶比普通 T4 DNA 连接酶热稳定性更好

45℃ 温度下,将 400 单位 T4 DNA 连接酶(NEB #M0202)或 Hi-T4 耐热 DNA
连接酶(NEB #M2622)与 1X T4 DNA 连接酶缓冲液,在无底物情况下预加热
如图所示时间后,所剩酶活进行如下检测:添加 0.12 µM 荧光标记的 HindIII
粘性末端片段 37℃ 温育 15 分钟,连接产物用毛细管电泳检测。
T4 DNA 连接酶在 45℃ 条件下,逐渐失去活性,而 Hi-T4 耐热 DNA 连接酶
即使在 45℃ 温育 72小时,对粘性末端底物仍有 100% 的活性。
 
图2:Hi-T4 耐热 DNA 连接酶比普通 T4 DNA 连接酶更耐热循环
 
在 1X T4 DNA连接酶缓冲液中,分别用 1000 单位的 T4 DNA 连接酶(NEB#
M0202)或 Hi-T4 耐热 DNA 连接酶(NEB# M2622)与 1 µg pBR322 进行循环
温育。循环温度设置为:42℃(A)或 50℃(B) 5 分钟,16℃ 5 分钟,
循环数如图显示:0、15、30、45、60。所剩酶活检测如下:25℃ 条件下,连
接荧光标记的 HindIII 粘性末端片段 10 分钟,连接产物用毛细管电泳检测。
相比于循环开始前的所剩酶活见图。
A. T4 DNA 连接酶在 16℃ 和 42℃ 循环温育时逐渐失去活性(金线,A),然
而 Hi-T4 耐热 DNA连接酶在 16℃ 和 42℃ 循环温育 60 次后仍保持活性
(橙色线,A)。
B. T4 DNA 连接酶在 16℃ 和 50℃ 循环温育 15 次后(金线,B)就完全失
活,然而 Hi-T4 耐热 DNA 连接酶在 16℃ 和 50℃ 循环温育 60 次(橙色
线,B)后仍保留 60% 左右的活性。
来源
重组表达纯化。
 
反应条件
1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液(50 mM Tris-HCl,10 mM MgCl2,10 mM DTT,1 mM ATP,(pH 7.5 @ 25℃)),25℃ 温育。
 
热失活
65℃ 加热 10 分钟。
 
质保声明
Hi-T4 耐热 DNA 连接酶经过严格的质控检测,确保该产品具有最高的活性和纯度。详情请登陆
www.neb.com 或 www3344xi.com。
 
单位定义(粘性末端活性单位)
1 单位指在 20 µl 反应体系中,25℃ 反应条件下,30 分钟能使 50% 的 6 µg经 HindIII 消化的λDNA 连接所需的酶量。
 
浓度
400,000 units/ml。
 
注意事项
1、与 E. coli DNA 连接酶需要 NAD+ 作辅因子不同,Hi-T4 耐热 DNA 连接酶的辅因子是 ATP。
2、若需稀释 Hi-T4 耐热 DNA 连接酶,推荐使用 50% 甘油贮存缓冲液稀释(稀释缓冲液A,
NEB #B8001S),-20℃ 保存。如稀释后马上使用,也可用 1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液稀释。
3、连接温度
连接粘性末端(1 x T4 DNA 连接酶缓冲液):在 20 µl 反应体系中加入 1 µl Hi-T4 DNA 连接酶,25 - 50ºC 温育 10 分钟。连接平末端或单碱基突出末端(1 x StickTogether DNA 连接酶缓冲液):在 20 µl 反应体系中加入 1 µl Hi-T4 耐热 DNA 连接酶,25 - 50ºC 温育 10 分钟。不要用加热来终止反应,因为
StickTogether DNA连接酶缓冲液里的 PEG 受热会抑制转化。
 
参考文献
该产品的特性和应用的参考文献,请登陆 www.neb.com 或 www3344xi.com。